微生物染色的基本原理：是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。化學(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對(duì)于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對(duì)酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對(duì)于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質(zhì)染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。相反，堿性物質(zhì)（如細(xì)胞質(zhì)）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。

影響染色的其它因素，還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細(xì)菌的染色。

染料的種類(lèi)：染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，分為酸性染料、堿性染料和中性（復(fù)合）染料三大類(lèi)。

1、酸性染料：這類(lèi)染料電離后染料離子帶負(fù)電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苦味酸和酸性復(fù)紅等，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。當(dāng)培養(yǎng)基因糖類(lèi)分解產(chǎn)酸使pH值下降時(shí)，細(xì)菌所帶的正電荷增加，這時(shí)選擇酸性染料，易被染色。

2、堿性染料：這類(lèi)染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。微生物實(shí)驗(yàn)室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細(xì)菌易被堿性染料染色。

3、中性（復(fù)合）染料：酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性（復(fù)合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細(xì)胞核的染色。

瑞氏染液及其配制

1、瑞氏染料是由堿性染料美藍(lán)（Methvlem blue和酸性染料伊紅（EostmY）合稱(chēng)伊紅美藍(lán)染料即瑞氏（美藍(lán)－伊紅Y）染料。

伊紅鈉鹽的有色部分為陰離子，無(wú)色部分為陽(yáng)離子，其有色部分為酸性，故稱(chēng)伊紅為酸性染料。美藍(lán)通常為氯鹽是堿性的，美藍(lán)的中間產(chǎn)物結(jié)晶為三氯化鎂復(fù)鹽，其有色部分為陽(yáng)離子，無(wú)色部分為陰離子，恰與伊紅鈉鹽相反。

2、用甲醇作瑞氏染料溶劑，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶劑，有兩種作用：

（1）甲醇使瑞氏染料中美藍(lán)（ M ）與伊紅（ E ）在溶液中離解，可使細(xì)胞成分選擇性吸附其中的有色物質(zhì)而著色。 

（2）甲醇具有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定在一定形態(tài)及增加細(xì)胞結(jié)構(gòu)的表面積，提高細(xì)胞對(duì)染料吸收作用，同時(shí)由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升溫，加速染色反應(yīng)。

3. 瑞氏染液配制：

（1） 瑞氏染液配制： 瑞氏染料 830gm 或 1g

甲醇（ AR ） 500ml 或 600ml

先稱(chēng)干燥（事先放入溫箱干燥過(guò)夜）瑞氏染料放置乳缽內(nèi)， 用乳棒輕輕 敲碎染料成粉末，再行研磨至聽(tīng)不到研芝麻聲 即呈細(xì)粉末，加少許甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸內(nèi)顯“一面鏡”光澤，而無(wú)染料粉粒沉著，再加較多量甲醇研磨呈一面鏡光亮，靜置片刻，將上層液體倒入一 清潔儲(chǔ)存瓶?jī)?nèi)（用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重復(fù)數(shù)次，直至乳缽內(nèi)染料及甲醇用完為止，搖勻，密封瓶口，存室溫暗處，儲(chǔ)存愈久，則染料溶解、分解就越好，一般儲(chǔ)存 3 個(gè)月以上為佳。

（2） 緩沖液：

1） 緩沖液作用：染色對(duì)氫離子濃度是十分敏感的，據(jù)觀(guān)察 pH 值的改變，可使蛋白質(zhì)與染料形成的化合物重新離解。緩沖液須保持 一定的 pH 使染色穩(wěn)定， PBS 的 pH 一般在 6.4~6.8 ，偏堿性染料可與緩沖液中 酸基起 中和作用，偏酸性染料則與緩沖液中的堿基起中和作用，使 pH 恒定。

2） 緩沖液配制（ pH6.4~6.8 ，弱酸性）：

　　配方 1 ： 配方 2 ：

　　1% KH2PO4 30ml M/15 KH2PO4 73.5 ml

　　1% Na2HPO4 20ml M/15 Na2HPO4 26.5ml

　　H2O（ 新鮮 ） 加至 1000ml

　　置室溫黑暗處，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染則應(yīng)報(bào)廢。