準(zhǔn)備工作：
    預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī)
    1. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，zui后一次吸干PBS；
    2. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer（1ml/107個(gè)細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶，0.5ml/5×106個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶）
    3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動(dòng)15min（EP管插冰上，置水平搖床上）
    4. 4℃，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中
    5. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
    6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景
    7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子
    8. （Bradford 法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個(gè)月）
    9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 μg/μl）
    10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異
    11. 4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育
    12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl“過渡抗體”（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）
    13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS
    14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）
    15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。
    RIPA Buffer配制：
    基礎(chǔ)成分：
    Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性）
    NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集）
    NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲(chǔ)存液）
    去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲(chǔ)存液；避光保存）
    注意：準(zhǔn)備激酶（致活酶）實(shí)驗(yàn)時(shí)，不要加去氧膽酸鈉，因?yàn)殡x子型去污劑能夠使酶變性，導(dǎo)致活性喪失。
    RIPA蛋白酶抑制劑
    苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200mM的儲(chǔ)存液，室溫保存）
    EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲(chǔ)存液，PH 7.4）
    亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20℃保存）
    抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20℃保存）
    胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20℃保存）
    RIPA磷酸（酯）酶抑制劑
    激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的儲(chǔ)存液，見Sodium Orthovanadate Activation Protoco）
    NaF（200mM的儲(chǔ)存液，室溫保存）
    注意：在準(zhǔn)備做磷酸（酯）酶實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，不加磷酸酯酶抑制劑
    工作液配制：
    配制100ml的modified RIPA buffe：
    1. 稱取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調(diào)節(jié)PH值到7.4
    2. 加10 ml 10%的NP-40
    3. 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清
    4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
    5. 理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應(yīng)該在使用當(dāng)天同時(shí)加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl），但是PMSF在水溶液中很不穩(wěn)定，30分鐘就會(huì)降解一半，所以PMSF應(yīng)該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5天。
    各種成分在工作液中的終濃度：
    • Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
    • NP-40: 1%
    • 去氧膽酸鈉：0.25%
    • NaCl: 150 mM
    • EDTA: 1 mM
    • PMSF: 1 mM
    • 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑: 各1 µg/ml
    • Na3VO4: 1 mM
    • NaF: 1 mM
    通過免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白
    1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。
    2．將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機(jī)上4℃以zui大速度離心15 min。
    3．收集上清（約30 ml）并加入30μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1 h。
    4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30 min。
    5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。zui后，用NETN洗一次。
    6．吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min。
    7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過夜。
    8．通過考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。
    9．從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min。
    10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫。
    11． 通過窄孔液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測序。