免疫共沉淀
2010/1/31
[3176]
免疫共沉淀
一 原理：
IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來(lái)的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。
實(shí)驗(yàn)zui需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書。特別是多抗的特異性是問題。
其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。
再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
每次實(shí)驗(yàn)之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。欲速則不達(dá)，確定好比例很必要。（待續(xù)）
二 準(zhǔn)備：
器械： 微量高速冷凍離心機(jī) 移液槍 旋轉(zhuǎn)盤 電泳設(shè)備 vortex震蕩器
液氮及組織粉碎器 eppentube
試劑： 細(xì)胞或組織 蛋白定量kit SDS電泳試劑 抗體（單抗時(shí)選擇protein G,二抗選擇抗鼠Ig兔血清） PBS NaN3 proteinA sapharose
試劑配制
抗原蛋白溶解緩沖液
1.RIPA緩沖液 （zui終濃度）
1MTris-HCL（PH7.4） 5ml （10mM）
5MNacl 15ml （150mM）
0.5M EDTA（PH7.4） 5ml （5mM）
20%TritonX-100 25ml （1%）
10% DOC 50ml （1%）
10%SDS 5ml （ o.1%）
TLCK 18.5mg （0.1mM）
TPCK 35mg （0.2mM）
DDW 395ml
toal 500ml
另外，使用之前加1mMPMSF（PMSF溶在酒精，濃度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水）
2.NP40 lysis 緩沖液
1MTris-HCL（PH7.4） 5ml （10mM）
5MNacl 15ml （150mM）
0.5M EDTA（PH7.4） 5ml （5mM）
20%NP40 25ml （1%）
TLCK 18.5mg （0.1mM）
TPCK 35mg （0.2mM）
DDW 450ml
toal 500ml
使用前加1mM的PMSF
注意點(diǎn)：
*Tris緩沖劑PH隨溫度變化，高濃度鹽酸滴定時(shí)發(fā)熱，冷卻后PH增高。
*反復(fù)使用PMSF要注意保管方法。
*1和2的緩沖劑的區(qū)別在于界面活性劑。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和，，DOC
*兩方都有EDTA，對(duì)抗原而言，二價(jià)離子Mg,Ca等是必要的。根據(jù)自己需要調(diào)節(jié)。EDTA用NaOH滴定。
IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來(lái)的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。
實(shí)驗(yàn)zui需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書。特別是多抗的特異性是問題。
其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。
再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
每次實(shí)驗(yàn)之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。欲速則不達(dá)，確定好比例很必要。（待續(xù)）
二 準(zhǔn)備：
器械： 微量高速冷凍離心機(jī) 移液槍 旋轉(zhuǎn)盤 電泳設(shè)備 vortex震蕩器
液氮及組織粉碎器 eppentube
試劑： 細(xì)胞或組織 蛋白定量kit SDS電泳試劑 抗體（單抗時(shí)選擇protein G,二抗選擇抗鼠Ig兔血清） PBS NaN3 proteinA sapharose
試劑配制
抗原蛋白溶解緩沖液
1.RIPA緩沖液 （zui終濃度）
1MTris-HCL（PH7.4） 5ml （10mM）
5MNacl 15ml （150mM）
0.5M EDTA（PH7.4） 5ml （5mM）
20%TritonX-100 25ml （1%）
10% DOC 50ml （1%）
10%SDS 5ml （ o.1%）
TLCK 18.5mg （0.1mM）
TPCK 35mg （0.2mM）
DDW 395ml
toal 500ml
另外，使用之前加1mMPMSF（PMSF溶在酒精，濃度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水）
2.NP40 lysis 緩沖液
1MTris-HCL（PH7.4） 5ml （10mM）
5MNacl 15ml （150mM）
0.5M EDTA（PH7.4） 5ml （5mM）
20%NP40 25ml （1%）
TLCK 18.5mg （0.1mM）
TPCK 35mg （0.2mM）
DDW 450ml
toal 500ml
使用前加1mM的PMSF
注意點(diǎn)：
*Tris緩沖劑PH隨溫度變化，高濃度鹽酸滴定時(shí)發(fā)熱，冷卻后PH增高。
*反復(fù)使用PMSF要注意保管方法。
*1和2的緩沖劑的區(qū)別在于界面活性劑。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和，，DOC
*兩方都有EDTA，對(duì)抗原而言，二價(jià)離子Mg,Ca等是必要的。根據(jù)自己需要調(diào)節(jié)。EDTA用NaOH滴定。
Protocol
1. 調(diào)制protein A sapharose
protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
離心2000轉(zhuǎn)2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，離心后去上清，重復(fù)2次，zui后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存
用單抗做一抗時(shí)，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清處理（每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清）。旋轉(zhuǎn)1-2h,混勻后，再離心1-2s去上清后，加PBS，vortex混合，離心去上清，重復(fù)二次加含0.02%NaN3的PBS到原來(lái)體積，冷存。避免長(zhǎng)期保存。
2．抗原的檢出
以下操作全在冰面或4度進(jìn)行去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，轉(zhuǎn)移到eppentube中用vortex混勻。RIPA的量：6cm的培養(yǎng)皿加1 ml（蛋白質(zhì)的量為500mg/ml）,組織塊用液氮粉碎，在緩沖劑中搗勻，蛋白定量。
30m，15000rpm離心，上清轉(zhuǎn)移到新tube 。不用移液槍，直接從tube倒進(jìn)另一個(gè)tube
往上清加抗體，1ml加2-5ul抗體，冷室內(nèi)旋轉(zhuǎn)混勻1h加protein A sapharose50ul，再混勻1h5000rpm離心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex 混勻，離心，去上清。重復(fù)4次洗凈。
加電泳用 sample 緩沖液40ul,2m煮沸，泳動(dòng)后，固定/干燥膠，現(xiàn)像。
3.注意點(diǎn)
A：不熟練使用移液槍，會(huì)混入沉淀的不溶性蛋白，使實(shí)驗(yàn)失敗。對(duì)無(wú)論怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速離心機(jī)。
B：對(duì)電泳的非特異條帶，zui后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗凈各一次。（完）
1. 調(diào)制protein A sapharose
protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
離心2000轉(zhuǎn)2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，離心后去上清，重復(fù)2次，zui后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存
用單抗做一抗時(shí)，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清處理（每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清）。旋轉(zhuǎn)1-2h,混勻后，再離心1-2s去上清后，加PBS，vortex混合，離心去上清，重復(fù)二次加含0.02%NaN3的PBS到原來(lái)體積，冷存。避免長(zhǎng)期保存。
2．抗原的檢出
以下操作全在冰面或4度進(jìn)行去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，轉(zhuǎn)移到eppentube中用vortex混勻。RIPA的量：6cm的培養(yǎng)皿加1 ml（蛋白質(zhì)的量為500mg/ml）,組織塊用液氮粉碎，在緩沖劑中搗勻，蛋白定量。
30m，15000rpm離心，上清轉(zhuǎn)移到新tube 。不用移液槍，直接從tube倒進(jìn)另一個(gè)tube
往上清加抗體，1ml加2-5ul抗體，冷室內(nèi)旋轉(zhuǎn)混勻1h加protein A sapharose50ul，再混勻1h5000rpm離心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex 混勻，離心，去上清。重復(fù)4次洗凈。
加電泳用 sample 緩沖液40ul,2m煮沸，泳動(dòng)后，固定/干燥膠，現(xiàn)像。
3.注意點(diǎn)
A：不熟練使用移液槍，會(huì)混入沉淀的不溶性蛋白，使實(shí)驗(yàn)失敗。對(duì)無(wú)論怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速離心機(jī)。
B：對(duì)電泳的非特異條帶，zui后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗凈各一次。（完）
