胚胎干細胞能在體外維持未分化狀態(tài)與正常核型、具有無限增殖能力,注入囊胚可形成嵌合體,可分化為來自三個胚層的各種細胞類型。ES細胞被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物和克隆動物,構(gòu)建醫(yī)學(xué)動物模型,研究人類基因功能。利用ES細胞可研究真核細胞的基因表達和調(diào)控,尋求細胞分化和細胞修復(fù)的機制,研究細胞、組織、器官移植。ES細胞的研究應(yīng)用已成為生命科學(xué)的熱點之一。目前哺乳動物ES細胞建系仍存在著品種單一、建系效率低等許多問題,嚴重影響了ES細胞的研究與應(yīng)用。本研究比較了不同種屬、胚齡、取材、分離、傳代方法及消化液、培養(yǎng)液對ES細胞分離培養(yǎng)的效果,對影響ES細胞分離建系的各種因素進行了研究,以求完善小鼠、兔、牛ES細胞的建系方法,提高建系效率。建立了一種不經(jīng)類胚體階段直接誘導(dǎo)小鼠EG細胞定向分化為神經(jīng)細胞的方法,為小鼠EG細胞向神經(jīng)細胞的體外分化研究提供參考。 1.采用分離5日齡小鼠胚胎外胚層進行昆明小鼠ES細胞分離培養(yǎng),與傳統(tǒng)分離ICM的方法相比顯著提高了昆明小鼠ES細胞的建系效率（12%&3.3%）;大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液與添加10ng/mL LIF的ES培養(yǎng)液相比,使分離ICM的胚胎傳至F1代的比例顯著提高（52%&36%）,傳至F2代的比例極顯著提高（40%&16%）;采用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液連續(xù)消化法進行ES細胞分離傳代,ICM形成ES細胞克隆的比例提高到50%,ICM獲得傳至第5代的ES細胞的比例提高至20%;昆明小鼠和BALB/C小鼠胚胎用于ES細胞分離時在胚胎貼壁率、ICM貼壁率、F1和F2代ES細胞出現(xiàn)率上無顯著差異;用絲裂霉素C處理MEF 1h適合作為ES細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層,添加10ng/mL LIF的ES培養(yǎng)液能有效抑制昆明小鼠ES細胞的分化。證實用改進的建系方法可有效地建立昆明小鼠ES細胞系。 2.從11.5～12.5日齡昆明小鼠胚胎生殖嵴分離培養(yǎng)PGCs,獲得了能連續(xù)傳9～11代的EG細胞系;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液多次消化生殖嵴,可有效地保持小鼠PGCs的活力;用差速貼壁法、與胎兒成纖維細胞共培養(yǎng)法分離PGCs,獲得了較多的PGCs原代克隆,所得的F1代EG細胞集落百分率顯著高于穿刺生殖嵴和取胎兒后1/3部位組織（21%、30%&7%、16%）;2株EG細胞系傳代達到11～13代,在第10代時檢測AKP呈陽性,第5代時在體外可分化為多種細胞。 3.對兔囊胚進行蛋白酶消化和機械切割分離出ICM,在MEF飼養(yǎng)層培養(yǎng),提高了ICM的貼壁率（60%）,獲得了較多的ES細胞集落,而用全胚或離散胚培養(yǎng)不能獲得可傳代培養(yǎng)的兔類ES細胞集落;應(yīng)用大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液提高了ICM貼壁率（59%）,能有效抑制兔類ES細胞的分化。證實了經(jīng)胚胎切割分離兔囊胚ICM在MEF飼養(yǎng)層上用大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng),能有效地建立兔類ES細胞系。 4.從14～18天兔胚胎生殖嵴及其周圍組織分離PGCs的過程中,用酶消化液加機械吹打,能獲得有增殖能力的兔PGCs;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液進行兔類EG細胞分離與傳代,所得到的EG細胞集落多,傳代數(shù)高于0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA濃度消化液組;采用兔PGCs與同源胎兒組織成纖維細胞共培養(yǎng)適合兔類EG細胞分離培養(yǎng),將兔類EG細胞克隆與成纖維細胞飼養(yǎng)層一起消化進行傳代,獲得了能連續(xù)傳代的兔類EG細胞系。 5.對5～13周齡牛胎兒生殖嵴分離PGCs時,用percoll液離心和差速貼壁法純化PGCs,與穿刺生殖嵴法和酶液消化法相比所得的PGCs集落數(shù)無差別,但前者后期培養(yǎng)中EG細胞傳代數(shù)高于后兩種方法（13, 7 & 5, 3）;大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液用于牛EG細胞培養(yǎng)時,所得PGCs集落數(shù)和EG細胞傳代數(shù)高于添加LIF的EG細胞培養(yǎng)液組（13&7）;牛胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層可支持牛EG細胞的增殖,并能有效抑制分化;冷凍保存不影響牛PGCs和EG細胞的活力;體外分化試驗和AKP染色證實了所分離的牛EG細胞具有多能性。證實了對牛PGCs進行純化后在牛胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層上用大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液進行培養(yǎng)能有效地建立牛EG細胞系。 6.用不經(jīng)過類胚體階段的誘導(dǎo)分化方法,對小鼠EG細胞在老化飼養(yǎng)層上長期培養(yǎng)使其達到高密度起動了EG細胞的神經(jīng)分化,獲得了較高比例的神經(jīng)細胞樣集落（62.9%（78/124））,用RA進一步進行誘導(dǎo)可產(chǎn)生TH+陽性神經(jīng)元細胞。經(jīng)檢測EG細胞源神經(jīng)細胞樣集落外層細胞以及從集落中遷出的細長細胞均表達神經(jīng)前體細胞標志nestin,應(yīng)用高濃度的RA對神經(jīng)細胞樣克隆誘導(dǎo),可獲得2.3±0.2%的TH+神經(jīng)元細胞。應(yīng)用不同濃度的RA對離散后的神經(jīng)細胞樣集落進行誘導(dǎo),TH+陽性細胞的比例在一定范圍內(nèi)隨著RA濃度升高和分化時間的延長而上升;對EG細胞源神經(jīng)前體細胞進行冷凍保存,解凍后細胞存活率83.2%,繼續(xù)培養(yǎng)仍具有增殖和分化能力,冷凍不影響EG源神經(jīng)前體細胞的活力。在不更換飼養(yǎng)層連續(xù)增殖達到高密度的情況下培養(yǎng)小鼠EG細胞,建立了一種簡單而有效的小鼠EG細胞體外分化為神經(jīng)細胞的培養(yǎng)體系,能有效產(chǎn)生TH+神經(jīng)細胞。