免疫酶組織化學(xué)技術(shù)的常用酶及其底物

（一）辣根過(guò)氧化物酶
在免疫酶技術(shù)中，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）是、應(yīng)用zui多的標(biāo)記酶，是從一種稱(chēng)為辣根的植物根部分離、純化獲得。HRP分子中含有含鐵血紅素基團(tuán)（高鐵血紅素），是HRP的活性基團(tuán)，在溶液中呈棕，HRP中的高鐵血紅素與H202形成一種復(fù)合物，然后脫水，氧原子形成。幾種底物可使HRP氧化，zui常用的有二種，即多酚和硝基鹽。HRP的優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面。
（1）體積小（分子質(zhì)量40kDa），不會(huì)遮蓋抗原的結(jié)合部位，且穿透力強(qiáng)，易與細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合。
（2）穩(wěn)定且易獲得高純度酶制品。
（3）具有較高活性及特異性。
（4）不溶性好，終產(chǎn)物不向周邊擴(kuò)散。
（5）組織中內(nèi)源性酶較少，抑制方法較多。
（6）價(jià)格相對(duì)較便宜。
（7）特異性底物是過(guò)氧化氫（H202），可選用不同電子供體（發(fā)色基團(tuán)），使終產(chǎn)物呈不同顏色。例如3，3’—二氨基聯(lián)苯胺（DAB）為棕褐色，3—氨基—9—乙基卡巴唑（AEC）為紅色，4—氯—1—苯酚（CN）為藍(lán)色。AEC室溫下較穩(wěn)定，產(chǎn)物不溶于水，但溶于有機(jī)溶劑，所以不能進(jìn)行脫水等處理；又因其需用水溶性封固劑，時(shí)間長(zhǎng)易褪色，限制了其應(yīng)用。DAB是廣泛應(yīng)用的電子供體，產(chǎn)物既不溶于水，又不溶于有機(jī)溶液，可長(zhǎng)期保存。其終產(chǎn)物具有嗜鋨性，經(jīng)鋨酸處理后電子密度增加，適用于電鏡下觀察。但DAB的缺點(diǎn)是具有潛在的致癌性，所以應(yīng)盡量減少吸人和接觸次數(shù)，并嚴(yán)格管理廢液。盡管有人反對(duì)應(yīng)用DAB，但目前還未找到一種比它更好的替代品，所以應(yīng)用依然。

HRP與底物H202呈色反應(yīng)原理見(jiàn)圖4—l。HRP的特異底物為H202，在分解Hz02過(guò)程中，與H202形成初級(jí)復(fù)合物，無(wú)電子供體時(shí)，反應(yīng)不再繼續(xù)進(jìn)行，當(dāng)電子供體存在時(shí)，反應(yīng)以一定的速度形成第二種復(fù)合物。HRP催化H202已形成的中間型產(chǎn)物，迅速生成水，酶被還原，電子供體被氧化、聚合，再經(jīng)氧化環(huán)化?zui后形成吲哚胺多聚體，此多聚體進(jìn)一步氧化、環(huán)化，形成苯乙肼聚合體，如供氫體是DAB，產(chǎn)物為棕褐色；如是AEC，產(chǎn)物為紅色。
 

（二）堿性磷酸酶
目前商品化的AKP均來(lái)源于牛小腸，稱(chēng)為牛腸堿性磷酸酶（calfintestinalkalinephos—phatase），其分子質(zhì)量為100kDa，故而穿透細(xì)胞組織的能力較弱。某些組織細(xì)胞內(nèi)含有較高的內(nèi)源性堿性和酸性磷酸酶，例如人體和鼠類(lèi)、狗等動(dòng)物組織的肝、腎、腸，對(duì)IHC染色會(huì)產(chǎn)生一定的干擾，因此限制了它的應(yīng)用。AKP主要用于血涂片或骨髓涂片的白細(xì)胞抗原檢測(cè)。但是由于AKP的呈色反應(yīng)的敏感性要比HRP高2—3倍，顯色時(shí)間可從30min到48h，可與HRP組合進(jìn)行IHC的雙重或多重標(biāo)記。另外，內(nèi)源性堿性磷酸酶可以在底物緩沖液中加入左旋咪唑（1evamisole）和鎂離子（氯化鎂），或提高底物緩沖液的pH值，可以有效地消除內(nèi)源性堿性磷酸酶，使該酶應(yīng)用比例日趨增多。目前該酶已廣泛應(yīng)用于原位雜交檢測(cè)的顯色和雙重酶標(biāo)染色。

（三）葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase，GOD）以葡萄糖為底物，生成藍(lán)色不溶性沉淀。該終產(chǎn)物較穩(wěn)定，不溶于有機(jī)溶劑，故易*保存，但因其分子質(zhì)量為150kDa，不能穿人細(xì)胞，影響了其應(yīng)用。另外，該酶的敏感性較低，主要是酶與底物反應(yīng)敏感性低。目前主要用于IHC的多重標(biāo)記。
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